PHمتر یا پی اچ متر
ژوئن 14, 2018
معرف ها و مواد شیمیایی
ژوئن 25, 2018

اسپکتروفتومتر(SPECTROPHOTOMETER)

فوتومتر و دستگاه اسپکتروفوتمتر یکی از تجهیزات آزمایشگاهی است که نور عبور یافته از محلول را اندازه گیری می نمایند تا غلظت ماده جاذب نور در محلول تعیین شود .

اجزاء اصلی دستگاه اسپکتروفتومتر

لامپ یا منبع نور در دستگاه اسپکتروفتومتر انرژی تشعشعی را تولید می کند . مونوکروماتور طول موج انتخابی نور عبور کننده از کووت را تعیین می نماید . کووت محل نگه داری نمونه در مسیر ثابت عبور نور قرارمی گیرد . آشکار ساز نسبت به انرژی تشعشع جذب نشده توسط نمونه حساس بوده و سیستم سنجش ) متریک ( نور عبور یافته را بر حسبT%  یا واحد جذب نوری ) توسط فرمولA=2-log T% )  اندازه گیری می نماید . در زیر هر یک از اجزاء دستگاه اسپکترومتر به تفصیل مورد بحث قرار گرفته اند.

Light Source Monochoromator Cuvette Detector Read out

ترتیب قرار گرفتن اجزاء دستگاه اسپکتروفتومتر تک شعاعی

منبع نور:

نقش منبع نور دستگاه اسپکتروفتومتر تولید انرژی تشعشعی می باشد . لامپ های تنگستن طول موج های زیادی را به طور ممتد از خود منتشر می سازند که جهت اندازه گیری در منطقه مرئی و ماوراء طیف بنفش ) از 351 تا 011 نانومتر ( مورد استفاده قرار می گیرند . از آنجائیکه در طول موج های پایین تر از 341 نانومتر پوشش شیشه ای فیلامان شروع به جذب می نماید بنابراین لامپ تنگستن جهت اندازه گیری طول موج های کمتر از 351 نانومتر توصیه نمی شود . بعضی نویسندگان طول موج بالاتر از 301 نانومتر را توصیه می نمایند . در درجه حرارت کار ، مقداری از فلز تنگستن بخار و در حباب شیشه ای لامپ متراکم می شود . سطح سیاه ایجاد شده در سطح داخلی لامپ از شدت انرژی تشعشعی کاسته و طیف نور خروجی را تغییر می دهد هنگام پیدایش سطح سیاه ، منبع نور را باید تعویض نمود تا از شکل گیری خطا جلوگیری به عمل آید.

از آنجائیکه لامپ دوتریوم در دستگاه اسپکتروفتومتر طیف ممتدی را در ناحیه ماوراء بنفش تولید می نماید بنابراین جهت اندازه گیری طول موج های ناحیه ماوراء بنفش استفاده می شود . از آنجائیکه طیف خارج شده از منبع نور با تغییرات درجه حرارت تغییر می نماید بنابراین ولتاژ باید به طور دقیق تنظیم شود تا از عدم تغییر طیف نوری مطمئن گشت.

مونوکروماتور:

نقش مونوکروماتور دستگاه اسپکتروفتومتر جداسازی طول موج مورد نظر و خارج کردن موج های ناخواسته می باشد . در فوتومتر با استفاده از فیلترها مخصوص طول موج دلخواه انتخاب می گردد . در فیلتر های شیشه ای طول موج های ناخواسته جذب می شوند . فیلتر مونوکروماتور صد در صد نمی باشد چون ممکن است نور با بیش از یک طول موج را عبور دهد . فیلتر ممکن است از یک یا چند لایه شیشه رنگی یا ژلاتین رنگی بین صفحات شیشه ای شفاف ) فیلترWratten )  ساخته شده باشد درجه خلوص طیف نور فیلتر تداخلی بیشتر از فیلتر شیشه ای می باشد . فیلتر تداخلی از دو قطعه شیشه آینه مانند با فاصله ساخته شده است . اندازه فاصله تعیین کننده طول موج انتخابی می باشد . این فاصله بایستی به طور دقیق نصف طول موج مورد نظر باشد . فیلتر تداخلی فقط طول موج های فاز را عبور می دهد . یعنی طول موج هایی که دو برابر فاصله یا مضرب  از فواصل هستند . مجموع انرژی طول موج های فاز جهت شکسته شدن در سطح آینه و ورود به کووت کافی می باشند . طول موج های دیگر به علت اختلاف فاز حذف و منتقل نمی شوند . همچنین فیلتر تداخلی بسیاری از طول موج های دلخواه را عبور می دهد ) آنهایی که ½ تا 2 برابر طول موج دلخواه هستند ( . بنابراین استفاده از فیلتر شیشه ای فرعی جهت حذف این طول موج های هارمونیک ضروری است . فیلتر تداخلی طول موج های ناخواسته را با از بین بردن تداخل ) و نه توسط جذب ( حذف می نماید.

دردستگاه اسپکتروفتومتر نور به صورت طیف پراکنده ازطول موج مورد نظر توسط شکاف های مکانیکی جدا می شود. به طور معمول بخش بسیار باریکی از نور جدا می شود . پهنای شکاف تعیین کننده پهنای نور عبور یافته به کووتاست. دستگاه اسپکتروفتومتر ساده دارای پهنای شکافی ثابت می باشد . در بیشتر دستگاه های اسپکتروفتومتر پیچیده پهنای شکاف تعیین کننده پهنای نور عبور یافته به کووت است . دستگاه اسپکتروفتومتر ساده دارای پهنای شکافی ثابت می باشد . در بیشتردستگاه های اسپکتروفتومتر پیچیده پهنای شکاف قابل تنظیم بوده می توان نور عبور یافته را به طور دستی انتخاب کرد.

همچنین می توان نور را توسط منشور یا سیستم gration به طیف طول موج تبدیل نمود . هنگام استفاده از منشور جهت تفرق نور ، طول موج های کوتاه شلوغ تر است . به طور معمول منشور شیشه ای مناسب تر از منشور کوارتزی است زیرا ماهیت تفرق آنها بهتر می باشد . به هر حال طول موج های کوتاه به طور عمده توسط شیشه جذب می شوند . جهت تولید طول موج های پایین تر 351 نانومتر جنس منشور باید کوارتزیاسیلیکای ترکیب شده باشد.

سیستمgrating  طیفی موازی یا خطی تولید می نماید . این سیستم از صفحه شدیداً صیقل داده شده با شکاف های بسیار موازی در فواصل نزدیک بهم ساخته شده است . در دستگاه اسپکتروفتومتر شعاع های انرژی تشعشعی حول یک گوشه تند منحرف گشته و درجه انحراف بستگی به طول موج دارد . با تصادم نور به سیستم  grating طیف های بسیار ظریف به ازاء هر یک از خطوط سیستمgrating  تشکیل می شود . با عبور نور از گوشه های شکاف دار پشتی ، طول موج های مورد نظر در جلو سیستمgrating  تولید می شوند . در طول موج ها هم فاز یکدیگر را تقویت و غیر هم فاز یکدیگر را حذف نموده و ناپدید می شوند . در این حالت کم طیف خطی ایجاد می شود . گرچه بطور معمول سیستمgrating  با تفرق خاص خود بهتر از منشور عمل نموده و طیف های طول موج را جدا می سازد اما به علت نقص در خط کشی شکاف ها ، خطای ناشی از نور مزاحم به احتمال زیاد در دستگاه های دارای سیستمgrating  بیشتر از دستگاه های با منشور است . نور مزاحم نوری است  که در طول موج های بالاتراز آنچه  که در دستگاه اسپکتروفتومتر تنظیم شده است به آشکار ساز برخورد می کند

جهت انتخاب طول موج دلخواه، منشور یا سیستمgrating  چرخیده می شود تا طول موج مناسب از شکاف به خارج هدایت شود . نور عبور یافته براساس پهنای آن مشخص  و عبارت از نوری است که از نمونه عبور و بر حسب نانومتر اندازه گیری می شود.

با رسم شدت نور خروجی از مونوکروماتور در مقابل طول موج و اندازه گیری پهنای قله ، نصف نور عبور یافته در ½ ارتفاع قله بدست می آید.

پاره ای از دستگاه ها قادر به جداسازی بخش باریکی از طیف نوری هستند .بنابراین نور برخورد یافته به کووت بیشتر تک رنگ خواهد بود .هرچه طول موج نور عبور یافته باریک تر باشد ، حساسیت دستگاه اسپکتروفتومتر به تغییرات غلظت بیشتر خواهد بود . در دستگاه های حساس ، حد تغییرات طول موج عبور یافته از 1 تا 2 نانومر و در دستگاه های با طول موج عبور یافته پهن ، به طور معمول ثابت  و حدود 11 نانومتر یا بیشتر است.

جهت بدست آوردن دقیق جذب نوری ، طیف نور عبور یافته از دستگاه اسپکتروفتومتر در ناحیه ½ ارتفاع قله باید ، 11/1 یا کمتر از پهنای قله باشد . به عنوان مثال پهنای ½ ارتفاع قله نیکوتین آمیدآدنین دی نوکلوئید( NADH )  در 341 نانومتر برابر 01 نانومتر است . جهت اندازه گیری NADH  در حد بسیار دقیق ، نور عبور یافته ازدستگاه اسپکتروفتومتر باید حداکثر در دامنه 350-334 نانومتر باشد . بسیاری از کروموفورها یا موادی که در بخش مرئی طیف نوری اندازه گیری می شوند ، دارای باند جذبی نسبتاً وسیعی عمدتاً 111 نانومتر یا بیشتر می باشند . بنابراین از دستگاه های با نور عبور یافته پهن نمی توان جهت اندازه گیری در بخش ماوراء بنفش استفاده نمود ، زیرا باندهای جذبی در این نواحی بسیار باریک ) 01 نانومتر یا کمتر هستند ( در حالیکه دستگاه های با نور عبور یافته باریک از قانونBeer  تبعیت می نمایند ، در دستگاه های با نور عبور یافته پهن از این قانون تبعیت نمی کنند

آشکار سازها:

نقش آشکارساز دستگاه اسپکتروفتومتر تبدیل انرژی نورانی الکتریکی است که متناسب با شدت نور برخورد کرده به سطح حساس آنها می باشد . فوتوسل ترکیبی از مواد حساس به نور می باشد که به صورت لایه ای سطح خارجی آن را پوشانده است . جهت فعال شدن فوتوسل نیازی به منبع ولتاژ خارجی نمی باشد . در اثر برخورد نور به فوتوسل ، جریانی از الکترون به طرف مدار خارجی به حرکت می افتد . از این نوع آشکار ساز در دستگاه های اسپکتروفتومتر با نور عبور یافته وسیع یا دستگاه هایی با میزان تابش بالا استفاده می شود . انرژی خروجی به ندرت تقویت می شود . لایه خارجی تحت تأثیر نور ممتد دچار افسردگی شده و از میزان انرژی الکتریکی خروجی آن با گذشت زمان کاسته می شود .لایه خارجی به کندی نسبت به تغییرات شدت نور پاسخ می دهد . به این دلیل آنها را نمی توان در دستگاه هایی که طیف طول موج را به صورتScan  در می آورند یا دستگاه هایی که ازChoppers   استفاده می کنند بکار برد .

همچنین انرژی الکتریکی خروجی وابسته به درجه حرارت نیز می باشد . پاسخ لایه پوشاننده فتوسل به تابش های بسیارشدید یا پایین خطی نمی باشد.

نوع دوم آشکار سازهای دستگاه اسپکتروفتومتر ، فتوتیوب می باشد که جهت راه افتادن نیاز به یک منبع ولتاژ خارجی دارد . در اثر تابش نور به فتوتیوب الکترون ها از کاتد خارج گشته و در یک آند جذب کننده تجمع می یابند . الکترون های تجمع یافته سپس از طریق مدار خارجی اندازه گیری خواهد شد . نوع ماده بکار رفته در ساخت کاتد ، تعیین کننده حد طول موج هایی است که درآن فتوتیوب حداکثر پاسخ را می دهند.

تیوب هایPhotomultiplier  نیز همانند فتوتیوب کار می کنند . در هر دو آنها الکترون های خارج شده از کاتد جذب یک سری آند به نام دینود( dynode )  می شوند . چون تیوب هایPhotomultiplier  علائم اولیه را تقویت می نمایند ، بنابراین سطوح پایین تابش را می توان توسط آنها اندازه گیری نمود . هر نوع نور مزاحم در عملکرد تیوب هایPhotomultiplier  تداخل آشکاری را ایجاد می نماید ، چرا که نور مزاحم نیز تقویت خواهد شد . از تیوب هایPhotomultiplier  به عنوان آشکارساز دستگاه های با نور عبور یافته باریک استفاده می شود چرا که نسبت به تغییرات شدت نور به سرعت پاسخ می دهند . بنابراین از این نوع آشکارسازها در دستگاه های دارایScanner  طول موج یا دستگاه های اسپکتروفتومتر دو شعاعی ) با زمان پاسخ سریع ( استفاده می شود.

وسیله قرائت دستگاه اسپکتروفتومتر

نقش دستگاه قرائت دستگاه اسپکتروفتومتر انرژی الکتریکی خروجی از آشکار ساز و سپس نمایش داده ها به شکل قابل تفسیر می باشد . به طور معمول داده ها را برحسب شدت نور با میزان جذب نوری نماش می دهند . بعضی دستگاه های اسپکتروفتومتر قادرند تا داده ها را به طور مستقیم بر حسب واحد غلظت گزارش نمایند.

وسایل قرائت عبارتند از : سیستم متریک ، سیستم دیجیتال ، سیستم چاپگر  ، سیستم ثبات با چاپ نواری که میزان عبور نور یا شدت جذب نوری را به شکل خط ترسیم می نماید.

منبع قدرت دستگاه اسپکتروفتومتر

شدت نور خارج شده از منبع نور باید ثابت باشد . واضح است چنانچه که ولتاژ تغییر نماید شدت نور لامپ تغییر خواهد یافت . تنظیم کننده های ولتاژ در دستگاه ها نصب گشته اند تا ولتاژ بکار رفته جهت آشکارساز و لامپ را ثابت نگه دارند . خطای ناشی از تغییرات ولتاژ را میتوان با بکار گیری اسپکتروفتومتر دو شعاعی از بین برد . شمای دو نوع اسپکتروفتومتر دو شعاعی در تصویر زیر نمایش داده شده است.

دردستگاه اسپکتروفتومتر دو شعاعیin-space  یک منبع نوری منفرد توسط آینه شکسته شده و سپس نور از دو  مونوکروماتور عبور می کند . نصف نور از کووت رفرانس و نصف دیگر از کووت نمونه عبور می نماید . علائم خروجی از هر یک از آنها یک تیوبPhotomultiplier  مجزا اندازه گیری می شود . دستگاه قرائت کننده دستگاه اسپکتروفتومتر علائم خروجی از هر آشکارساز را مقایسه می نماید .

نسبت دو علائم نشانگر ولتاژ خروجی است.

اسپکتروفتومتر دو پرتویی ( دو شعاعی) 

هرگونه تغییر ولتاژ که روی شدت بازده منبع انرژی تشعشعی تأثیر بگذارد روی دو علامت نیز به یک میزان تأثیر خواهد داشت . از آنجائی که هردو نمونه به یک نسبت تحت تأثیر قرار خواهند گرفت ، نسبت یکسان باقی مانده و خطائی ایجاد نمی شود.

در دستگاه اسپکتروفتومتر دو شعاعیin-time  فقط از یک آشکار ساز استفاده می شود . یک صفحه چرخان با داشتن یک وزنه بعد از سیستم کووت ها قرار گرفته که به طور متناوب به صورت آینه عمل می کند . صفحه چرخان به طور متناوب شعاع های نوری حاصل از کووت نمونه و کووت رفرانس را به آشکار ساز هدایت و چرخان به طور متناوب شعاع های نوری حاصل از کووت نمونه و کووترفرانس را به آشکار ساز هدایت و بدین طریق آشکار ساز تفاوت بین دو منبع را مشخص می نماید . ترتیب قرا گرفتن اجزاء دستگاه اسپکتروفتومتر طوری است که خطای ناشی از پاسخ نابرابر تیوب هایPhotomultiplier  دوتایی را حذف می نماید.

 سل اسپکتروفتومتر(SEPECTROPHOTOMETER CELL):

در دستگاه های آزمایشگاهی در زمان اندازه گیری، جذب و ایجاد مسیر برای عبور نور، از سلاسپکتروفتومتر استفاده می شود. کووت ها دو نوع مختلف دارند که گرد یا مربع می باشند. ترجیح بر این است که از نوع مربعی به جای گرد استفاده شود، چون در سطوح استوانه ای هنگاه عبور نور، بخاطر اثر انعکاس یا انحراف، مقداری از نور از بین می رود، ولی چون سل اسپکتروفتومتر های مربعی شکل سطوحی پهن دارند، میزان از بین رفتن نور خیلی کم است، مسیر نور نیز در کوت های مربعی ثابت می باشد و معمولا یک سانتی متر می باشد، ولی مسیر نور در سل اسپکتروفتومتر های گرد تغییر می کند چون حتماً این کووت ها گرد نبوده و ممکن است بیضی شکل باشد. این کووت های گرد باید یک دست و به طور مناسب در دستگاه قرار گیرند. از کووت هایی که به صورت یک دست ساخته شده اند به روش زیر میتوان استفاده کرد:

  1. باید غلطت ماده رنگی درون محلول را طوری انتخاب نمایید که بتوانید طول موج آن را با تقریب51%T بخوانید.
  1. طول موج اختصاصی دستگاه را تنظیم و بلانک رفرانس را بر روی 111%T تنظیم کنید.
  2. یکی از سل اسپکتروفتومتر ها را با محلول پر کرده و%T را بخوانید.
  3. سپس محولول را در سل اسپکتروفتومتر خشک دیگری بریزید و %T آن را بخوانید.
  4. سل اسپکتروفتومتر ها را بچرخانید تا در بهترین حالت برای خواندن%T قرار گیرند، تا بتوانید نتیجه را با سل اسپکتروفتومتر اولیه مقایسه نمایید.

توصیه می شود که بالای سطح سل اسپکتروفتومتر ها را علامت گذاری کنید تا به صورت درست در سل اسپکتروفتومتر قرار      گیرند. این علامت گذاری ها میتواند در خواندن اطلاعات در آینده به شما کمک کنند. اختلاف بین کووت ها باید حداکثر تا 1.5%T باشد، اگر از این حد تجاوز شده باشد، باید لوله های نامناسب را دور ریخت.

در طیف مرئی بین 351 تا 011 نانومتر ترجیح بر این است که از کووت های پلاستیکی یا شیشه ای استفاده شود. کووت های شیشه ای نور ماورا بنفش را به خود جذب می نمایند، در نتیجه از این نوع کووت در طول موج های زیر 351 نانومتر نمی شود استفاده کرد. برای طول موج های ماوراء بنفش یعنی طول موج هایی بین 211 تا 411 نانومتر از سل اسپکتروفتومتر های کواتز یا سیلیکا ترکیب شده استفاده می شود.

تمیز کردن کووت ها پس از استفاده الزامی است و به هیچ وجه نباید در محلول های دترجنت آنها را گذاشت. باید این کووت ها را با دترجنت های ضعیف شست و بعد از آن آنها را با آب معمولی و آب دیونیزه آبکشی نمود و بر روی جا لوله ای پلاستکی به صورت وارونه قرار داد تا خشک گردند.

چگونه یکسان بودن سل اسپکتروفتومتر ها را ارزیابی نماییم؟

برای جلوگیری از اشکالات اندازه گیری کمیت ها در تکرارهای زیاد، ضروری است که کووت ها جذب نوری یکسانی داشته باشند.

برای ارزیابی یکسان بودن سل اسپکتروفتومتر ها، از آب مقطر استفاده کنید و سپس جذب نور در طول موج 551 نانومتر را خوانده و کووت هایی که بیش از 1.11± اختلاف دارند برای آزمایش استفاده نمیکنیم و یا با استفاده از محلول دیگری به نام سیان مت هموگلوبین است، طول موج 541 نانومتر را امتحان میکنیم و سل اسپکتروفتومتر هایی که بیش از 1.115 اختلاف جذب داشتن را در آزمایش بکار نمی بریم.

تا جایی که امکان دارد با یک سل اسپکتروفتومتر تمام اندازه گیری های بلانک، استاندارد و آزمایش ها صورت گیرد تا از هرگونه خطایی جلوگیری شود.